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(무기화학)배위화학3-전자스펙트럼2-2(흡광도)
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몰 흡수율을 계산하는 방법

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게시판 > 질답게시판 > 저번에 기기분석에 대한질문인데 풀어 보고 질문들입니다^^

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280nm에서 단백질 흡광계수 이론적으로 계산하기 (Extinction coefficient)

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280nm에서 단백질 흡광계수 이론적으로 계산하기 (Extinction coefficient) 본문

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280nm에서 단백질 흡광계수 이론적으로 계산하기 (Extinction coefficient)
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분석 몰흡광계수 계산 문제 질문입니다 – ☞ 화학 (비댓 금지) – 물♡화♡생♡지

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분석 몰흡광계수 계산 문제 질문입니다 - ☞ 화학 (비댓 금지) - 물♡화♡생♡지
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Beer-Lambert Law. 1.50 cm 3.75 mg/100 mL 480 nm 39.6%

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Beer-Lambert Law. 1.50 cm 3.75 mg/100 mL 480 nm 39.6%
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280nm에서 단백질 흡광계수 이론적으로 계산하기 (Extinction coefficient)

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1. 서론

생물공학 실험에서 분광기(Spectrophotoscopy)를 이용하여 흡광계수(Extinction coefficient)를 정확히 측정하는 것은 중요합니다.

비어 람버트 식(Beer Lambert equation)을 통해 흡광도(A), 흡광계수(ε), 농도(C), 셀 길이(L)를 구할 수 있습니다.

비어 람버트 식: A = εCL

일반적으로, 분광기(Spectrophotoscopy)를 사용하여 흡광도(A)를 측정하고, 측정했던 농도(C)를 알고 있기 때문에

Standard curve를 그리고, 기울기를 측정하여 해당 단백질의 흡광계수(ε)를 측정할 수 있습니다.

특히, 단백질의 경우 트립토판(Trp), 타이로신(Tyr), 시스테인(Cys) 등 아미노산이 280nm에서 흡광도를 나타내는데 중요한 역할을 합니다.

2. 흡광계수 이론적 예측의 필요성

해당 시료가 없어 당장 실험을 진행할 수 없거나, 시료가 너무 적어 실험을 진행하기 어려울 경우

280nm에서 단백질의 흡광계수(ε)를 이론적으로 계산하고 우리가 원하는 영역의 흡광도(A)를 나타낼 수 있습니다.

비어 람버트 식: A = εCL

예를 들어, 해당 시료의 흡광도(A)를 1로 나타내고 싶다면,

비어 람버트 식: 1 = εCL

C = 1 / εL

로 흡광계수(ε)만 알 수 있다면 실험에 필요한 농도를 특정할 수 있습니다.

(물론, 가장 빠른 방법은 280nm에서 흡광계수(ε)의 Reference를 찾는 것입니다.)

3. 흡광계수 이론적 예측

https://www.rcsb.org/

PDB bank에서 흡광계수 예측을 위한 단백질 코드(Sequence)를 불러옵니다.

예를 들어, T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 아미노산 코드입니다.

SEQRES 1 A 164 MET ASN ILE PHE GLU MET LEU ARG ILE ASP GLU GLY LEU

SEQRES 2 A 164 ARG LEU LYS ILE TYR LYS ASP THR GLU GLY TYR TYR THR

SEQRES 3 A 164 ILE GLY ILE GLY HIS LEU LEU THR LYS SER PRO SER LEU

SEQRES 4 A 164 ASN ALA ALA LYS SER GLU LEU ASP LYS ALA ILE GLY ARG

SEQRES 5 A 164 ASN CYS ASN GLY VAL ILE THR LYS ASP GLU ALA GLU LYS

SEQRES 6 A 164 LEU PHE ASN GLN ASP VAL ASP ALA ALA VAL ARG GLY ILE

SEQRES 7 A 164 LEU ARG ASN ALA LYS LEU LYS PRO VAL TYR ASP SER LEU

SEQRES 8 A 164 ASP ALA VAL ARG ARG CYS ALA LEU ILE ASN MET VAL PHE

SEQRES 9 A 164 GLN MET GLY GLU THR GLY VAL ALA GLY PHE THR ASN SER

SEQRES 10 A 164 LEU ARG MET LEU GLN GLN LYS ARG TRP ASP GLU ALA ALA

SEQRES 11 A 164 VAL ASN LEU ALA LYS SER ARG TRP TYR ASN GLN THR PRO

SEQRES 12 A 164 ASN ARG ALA LYS ARG VAL ILE THR THR PHE ARG THR GLY

SEQRES 13 A 164 THR TRP ASP ALA TYR LYS ASN LEU

280nm에서 흡광도를 나타내는 트립토판(Trp), 타이로신(Tyr), 시스테인(Cys)의 개수를 세어줍니다.

T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 경우

트립토판(Trp): 3개

타이로신(Tyr): 5개

시스테인(Cys): 2개

흡광계수(ε) (280nm) = 트립토판(Trp) * 5500 + 타이로신(Tyr) * 1490 + 시스테인(Cys) * 125

T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 경우

흡광계수(ε) (280nm) = 3 * 5500 + 5 * 1490 + 2 * 125 = 24200

T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 흡광계수(ε)는 24200M-1cm-1로 예측되었습니다.

3. 흡광계수 이론적 예측과 실험적 실제 값 비교

실제로, T4 Lysozyme(라이소자임)의 흡광계수(ε)는 24227M-1cm-1로

T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 흡광계수(ε) 예측값인 24200M-1cm-1과 비슷하게 예측되었습니다.

따라서,

비어 람버트 식: A = εCL

비어 람버트 식에 적용하여 흡광도 1로 측정되도록 하고 싶다면

비어 람버트 식: 1 = εCL

비어 람버트 식: C = 1 / εL = 1 / 24200

C = 0.041 mM

결국, 0.041mM의 농도로 T4 Lysozyme(라이소자임)을 분광기(Spectrophotoscopy)로 측정하면

흡광도 1에 가까운 값을 구할 수 있습니다.

4. 참고자료

Gill, Stanley C., and Peter H. Von Hippel. “Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.” Analytical biochemistry 182.2 (1989): 319-326.

Pace, C. Nick, et al. “How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.” Protein science 4.11 (1995): 2411-2423.

Anders, John C., et al. “Using amino acid analysis to determine absorptivity constants: A validation case study using bovine serum albumin.” Biopharm international 16 (2003): 30-43.

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Beer-Lambert Law. 1.50 cm 3.75 mg/100 mL 480 nm 39.6%

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Beer-Lambert Law. 1.50 cm 3.75 mg/100 mL 480 nm 39.6%

1.50 cm의 셀에 들어있는 3.75 mg/100 mL A (분자량 220 g/mol) 용액은

480 nm에서 39.6%의 투광도를 나타내었다.

A의 몰흡광계수는?

—————————————————

Beer-Lambert Law. 비어-람베르트 법칙

A = εbC

> ε의 단위: M^-1 cm^-1

> b의 단위: cm

> C의 단위: M

용액의 몰농도를 계산하면,

(3.75/1000 g) / (220 g/mol) / 0.100 L

= 0.00017045 mol/L

= 0.00017045 M

%T = 39.6%

—> T = (39.6/100) = 0.396

A = –log(T)

= –log(0.396)

= 0.4023

ε = A / bC

= 0.4023 / (1.50 × 0.00017045)

= 1573.48

= 1.57×10^3

답: 1.57×10^3

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[키워드] 비어 램버트 법칙 기준문서, 비어 기준문서

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